Recientemente se demostró que las CD pueden ser expandidas directamente in vivo. La administración del ligando de Flt3 durante 10 días produjo un incremento de 20 veces el número de CD circulantes en pacientes con cancer de colon (15). Esta estrategia podría constituirse en otra alternativa viable para la obtención de cantidades adecuadas de CD para la producción de vacunas autólogas.
Valone y col. (16) emplean CD circulantes en sus protocolos clínicos. Han demostrado que las CD obtenidas por procedimientos de aféresis y posteriores purificaciones en gradientes de diferentes densidades, maduran espontaneamente in vitro en medio libre de suero y citoquinas. Sin embargo, hasta el presente la mayoría de los experimentos pre-clínicos y protocolos de vacunación se han llevado a cabo con CD obtenidas in vitro. Las dos fuentes celulares más frecuentemente empleadas como población de partida para la generación de cantidades adecuadas de CD maduras in vitro son: células progenitoras CD34+ (17, 18) y monocitos CD14+ (19, 20). (ver Figura 4)

Los monocitos pueden ser diferenciados a CD inmaduras por el agregado de la combinación de GM-CSF e IL-4 al medio de cultivo, mientras que la mayoría de los protocolos para producir CD a partir de células CD34+ incluyen el agregado de citoquinas adicionales como SCF y el ligando de Flt3.
La obtención de CD maduras se logra con la posterior adición de un estímulo como el cross-linking con CD40 (21), patógeno (22), LPS (23), ADN (24), proteínas de "heat shock" (25) y citoquinas como el cocktail definido por Jonuleit que incluye TNF-a, IL-1, IL-6 y PGE-E2 (26).

En nuestro laboratorio el empleo de TNF- como única citoquina de maduración ha mostrado ser muy efectivo. Fenotipicamente las CD maduras se definen por la expresión de marcadores de maduración como el CD83 y el aumento de la expresión de moléculas coestimulatorias como el CD80 y CD86. Considerando las células cuyo fenotipo es CD14-, HLA-DR++, CD86+, CD1a, CD83+ hemos obtenido un promedio de 88% de células dendríticas maduras (ver Tabla 1). Las CD fueron obtenidas a partir de monocitos. Puede observarse el perfil de expresión de marcadores de superficie en cada una de las muestras cultivadas.

Una vez obtenidas las CD se procede a "cargarlas" o "pulsarlas" con el antígeno de interés. Los antígenos intracelulares originados por ejemplo de virus o microorganismos que viven intracelularmente son principalmente presentados por moléculas de CMH clase I. Estos son reconocidos por linfocitos CD8+ citotóxicos dando como resultado la activación de una respuesta inmune predominantemente mediada por células.
En el caso de antígenos que se originan de patógenos extracelulares y que penetran a la célula por fagocitosis o pinocitosis la situación es diferente. Estos antígenos son presentados por moléculas CMH clase II que son reconocidas por linfocitos T CD4+, proceso que origina la activación de una respuesta predominantemente humoral. Dependiendo de la estructura del antígeno y del tipo de respuesta inmune deseada se emplean distintos estadíos madurativos de las CD (27).

Se han descripto tres estrategias de carga antigénica para su aplicación clínica:

• Carga con ADN

Este método se basa en insertar genes de antígenos en el genoma de las CD. Los antígenos pueden ser incorporados como ADN que luego es transcripto y traducido por la misma célula. La proteína producida es degradada durante el proceso de metabolismo normal celular. Los péptidos así generados pueden ser cargados en moléculas de CMH y presentados en la superficie celular.

Debido a que solamente se han identificado antígenos específicos para una minoría de tumores, numerosos estudios han reportado el empleo de lisados de células tumorales o proteínas específicas de patógenos. Las células de elección para esta estrategia son las CL, debido a que se requiere una activa internalización del antígeno.
Los péptidos obtenidos como producto de la degradación de las proteínas dentro de los endosomas son principalmente cargados en moléculas CMH clase II. De este modo, Chakraborsty y col. (30) describieron la inducción de linfocitos T citotóxicos in vivo en pacientes con melanoma.

Recientemente se han realizado estudios empleando células apoptóticas de tumor como fuente antigénica. La internalización de células apoptóticas por las CD es muy eficiente. Además Albert y col. (9) demostraron una presentación cruzada antigénica no solamente sobre moléculas de CMH clase II sino también sobre clase I.
Una estrategia diferente que también emplea células tumorales es el uso de híbridos de tumor-CD generados por electrofusión o tratamiento con polietilen-glicol. Se ha descripto la obtención de hasta un 20% de híbridos que muestran un fenotipo comparable al de las CD y que representarían a una célula tumoral que ha adquirido las características coestimulatorias de una CPA. Kugler y col. (31) han empleado estos híbridos en ensayos clínicos en pacientes con carcinoma renal.

La desventaja de estas estrategias que emplean células tumorales como fuente de antígenos radica en la posibilidad de que los antígenos presentados a las CD incluyan no solamente a aquellos del tumor, sino también a antígenos de tejidos normales. Cabe la duda, entonces, de que pueda inducirse autoinmunidad. No obstante, ningún caso de desarrollo de una enfermedad autoinmune de novo ha sido descripto hasta el presente.

• Carga con péptidos específicos del tumor

Una estrategia promisoria en la que se emplean CD maduras es el uso de péptidos específicos obtenidos por síntesis que son cargados directamente sobre las móleculas de CMH de superficie. La ventaja de este método es el empleo de antígenos bien definidos lo que reduce la posibilidad del desarrollo de un proceso autoinmune y reactividad cruzada y facilita el monitoreo tanto in vitro como in vivo de la respuesta obtenida.
La desventaja de este método es su limitación a tumores con antígenos definidos (por ej.: melanoma, carcinoma de próstata, mieloma múltiple), su restricción a determinadas clases de HLA, resultando en la exclusión de un número significativo de pacientes de este tipo de tratamiento y la inducción de un repertorio de células T restringido menos adecuado para controlar una variación antigénica tumoral.